- Код статьи
- S3034510325080012-1
- DOI
- 10.7868/S3034510325080012
- Тип публикации
- Статья
- Статус публикации
- Опубликовано
- Авторы
- Том/ Выпуск
- Том 61 / Номер выпуска 8
- Страницы
- 3-9
- Аннотация
- Одной из проблем при синтезе фрагментов ДНК является возникновение ошибок. Количество ошибок, связанных с протоколами синтеза, ограничивает эффективность получения синтетических фрагментов ДНК как в малых, так и в больших масштабах. В данной работе мы предлагаем новый быстрый протокол получения синтетических фрагментов ДНК с использованием термостабильной эндонуклеазы V из (Tma-эндонуклеаза) в качестве фермента для коррекции ошибок. Цель исследования – разработка методики одностадийной коррекции ошибок при синтезе генов de novo. Был получен рекомбинантный фермент Tma-эндонуклеаза. Для проверки эффективности коррекции ошибок с помощью Tma-эндонуклеазы проводился синтез гена mTomato с использованием различных протоколов. Эффективность работы фермента оценивалась визуально по количеству флуоресцирующих колоний. Для подтверждения результата были сформированы случайные выборки колоний и проведено секвенирование собранных последовательностей по Сэнгеру. Было показано, что Tma-эндонуклеаза может быть использована как в классическом трехстадийном, так и в быстром одностадийном протоколе коррекции ошибок без потери активности. Также установлено, что при сопоставимой точности синтеза фрагментов ДНК эффективность Tma-эндонуклеазы такая же, как для коммерческого фермента Correctase (ThermoFisher). Сделан вывод, что одностадийная коррекция ошибок при помощи эндонуклеазы V позволяет ускорить процесс синтеза фрагментов ДНК и коррекции ошибок в них. За счет уменьшения количества операций данный протокол лучше подходит для высокопроизводительных платформ для синтеза ДНК, чем классический с использованием нетермостабильных ферментов.
- Ключевые слова
- синтетическая биология коррекция ошибок синтез
- Дата публикации
- 24.03.2025
- Год выхода
- 2025
- Всего подписок
- 0
- Всего просмотров
- 16
Библиография
- 1. Fisunov G.Y., Semashko T.A., Evsyutina D.V. et al. Synthesis of the genome of bacteriophage N4 // Probl. Osobo Opas. Infekc. 2024. № 1. P. 182–191. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2024-1-182-191
- 2. Thi Nhu Thao T., Labroussaa F., Ebert N. et al. Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform // Nature. 2020. V. 582. № 7813. P. 561–565. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2294-9
- 3. Hutchison C.A., Chuang R.Y., Noskov V.N. et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome // Science. 2016. V. 351. № 6280. https://doi.org/10.1126/science.aad6253
- 4. Gibson D.G., Benders G.A., Andrews-Pfannkoch C. et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome // Science. 2008. V. 29. № 319(5867). P. 1215–1220. https://doi.org/10.1126/science.1151721
- 5. Gibson D.G., Glass J.I., Lartigue C. et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome // Science. 2010. V. 329. № 5987. P. 52–56. https://doi.org/10.1126/science.1190719
- 6. Semashko T.A., Fisunov G.Y., Tsoy E.A. et al. Modern approaches to de novo synthesis of extended DNA fragments: Аssembly of a wide repertoire of sequences // Acta Naturae. 2024. V. 16. № 1–60. P. 77–85. https://doi.org/10.32607/actanaturae.27362
- 7. Desai N.A. and Shankar V. Single-strand-specific nucleases // FEMS Microbiol. Rev. 2003. V. 26. № 5. P. 457–491. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2003.tb00626.x
- 8. Yang B., Wen X., Kodali N.S. et al. Purification, clo-ning, and characterization of the CEL I nuclease // Biochemistry. 2000. V. 39. № 13. P. 3533–3541. https://doi.org/10.1021/bi992376z
- 9. Smith J. and Modrich P. Removal of polymerase-produced mutant sequences from PCR products // Proc. Natl Acad. Sci. 1997. V. 94. № 13. P. 6847–6850. https://doi.org/10.1073/pnas.94.13.6847
- 10. Ma S., Saaem I., and Tian J. Error correction in gene synthesis technology // Trends Biotechnol. 2012. V. 30. № 3. P. 47–54. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2011.10.002
- 11. Sequeira A.F., Guerreiro C.I.P.D., Vincentelli R., Fontes C.M.G.A. T7 endonuclease I mediates error correction in artificial gene synthesis // Mol. Biotechnol., 2016. V. 58. № 8–9. P. 573–584. https://doi.org/10.1007/s12033-016-9957-7
- 12. Huang J., Lu J., Barany F., Cao W. Multiple cleavage activities of endonuclease V from Thermotoga maritima: Recognition and strand nicking mechanism // Biochemistry. 2001. V. 40. № 30. P. 8738–8748. https://doi.org/10.1021/bi010183h
- 13. Semashko T.A., Fisunov G.Y., Tsoy E.A. et al. Modern approaches to de novo synthesis of extended DNA fragments: Assembly of a wide repertoire of sequences // Acta Naturae. 2024. V. 16. № 1–60. P. 77–85. https://doi.org/10.32607/actanaturae.27362
- 14. Inoue H., Nojima H., and Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. V. 30. № 96. P. 8–23. https://doi.org/10.1016/0378-1119 (90)90336-p
- 15. Geissmann Q. OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects // PLoS One. 2013. V. 8. № 2. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0054072
